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    組氨酸標簽蛋白親和純化介質過濾層析法

    描述:組氨酸標簽蛋白親和純化介質過濾層析法 Ni IDA Beads填料可以用于各種表達來源(如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞)的組氨酸標簽(6xHis-tagged)蛋白的純化。

    更新時間:2024-02-04
    產品型號:Ni IDA Beads填料
    廠商性質:經銷商
    詳情介紹

    組氨酸標簽蛋白親和純化介質過濾層析法 Ni IDA Beads填料

          Ni IDA Beads可以用于各種表達來源(如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞)的組氨酸標簽(6xHis-tagged)蛋白的純化。它是以4%瓊脂糖凝膠為基質,通過化學方法偶聯了三配位的亞氨基二乙酸(IDA),螯合鎳離子(Ni2+)后,可以形成比較穩定的平面四邊形結構,從而有更多的位點與組氨酸標簽上的咪唑環繼續配位,達到結合目的蛋白的效果。但是,這樣的結構比較容易受到其他小分子的進攻,鎳離子易被還原或者被螯合,從而破壞其化學結構,無法結合目的蛋白。Ni IDA Beads具有載量高,性能和價值匹配等優點。


    NI IDA示意圖


    1. Ni IDA Beads產品性能

    項目

    性能

    基質

    4%瓊脂糖凝膠

    載量(/mL基質)

    >40mg 6XHis-tagged protein

    微球粒徑(μm

    45–165

    最大壓力

    0.1 MPa, 1 bar

    儲存緩沖液

    20% 乙醇的1XPBS

    儲存溫度

    4°C-30°C


    2.純化流程

    2.1 緩沖液的準備

    可使用下列推薦緩沖液,也可根據自己的使用習慣配置不同的緩沖液體系,基本原理就是低咪唑上樣,高咪唑洗脫。緩沖液在使用前盡量用0.22 μm 或者0.45 μm 濾膜過濾除菌。具體配置方法見表2。


    組氨酸標簽蛋白親和純化介質過濾層析法 Ni IDA Beads填料純化蛋白流程:

    2.2.1 細菌或酵母表達的蛋白

    1)挑取單菌落到培養基中,根據載體使用說明,加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間。

    2)表達結束后,將培養液轉移到離心杯中,7,000 rpm(7,500×g),離心15min 收集菌體,然后按照菌體∶Lysis Buffer=1∶10(WNV)加入

    Lysis Buffer,加入終濃度為 1mM的 PMSF。加入溶菌酶(工作濃度為 0.2-0.4 mg/ml,如果表達的宿主細胞內含 pLysS 或 pLysE,可以不加溶菌酶),同時也可加入其他蛋白酶抑制劑,但不能影響目的蛋白與樹脂的結合)。

    3)將菌體沉淀懸浮起來,(如果菌液濃度高,也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 μg/ml DNase I),混勻,放置于冰上,然后冰上超聲破碎細胞,至菌液基本保持澄清。

    4)將澄清的破碎液轉移至離心管中,10,000 rpm(15,000×g),4℃離心 20-30 min。取上清,置于冰上備用或-20℃保存。

    2.2.2 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白

    1)將細胞培養液轉移至離心杯,5.000 rpm(3.800×g);離心10min,收集菌體得上清,如上清中不含 EDTA、組氨酸和還原劑等物質,即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA、組氨酸和還原劑等物質,需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子。2)對于大量體積的上清,需加入硫酸銨沉淀濃縮后,蛋白還需用 Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

    2.3 Ni IDA Beads 重力柱的裝填

    1)取合適規格的重力層析柱,裝入下墊片,加入適量純水潤洗柱管和墊片,關閉下出口。

    2)將 Ni IDA Beads 混合均勻,用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中(介質實際體積占懸液的一半),打開下出口流干保護液。

    3)加入適量純水沖洗介質,待柱管中液體重力流干后,關閉下出口。

    4)裝入潤洗后的上墊片,確保墊片與填料之前沒有空隙,且保持水平。

    5)裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡,暫不使用時則加入保護液,4-30℃保存。


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